φ29-DNA-Polymerase
| φ29-DNA-Polymerase | ||
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| nach PDB 1XHX | ||
| Andere Namen |
Bacillus phage φ29 gene product 2 | |
| Masse/Länge Primärstruktur | 575 Aminosäuren, 66.714 Da | |
| Bezeichner | ||
| Externe IDs | ||
| Enzymklassifikation | ||
| EC, Kategorie | 2.7.7.7 | |
| Orthologe (Bacillus phage φ29) | ||
| Entrez | 6446511 | |
| UniProt | P03680
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| PubMed-Suche | 6446511
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Die φ29-DNA-Polymerase ist ein Enzym aus der Gruppe der DNA-Polymerasen und wird vom Bakteriophagen φ29 gebildet.
Eigenschaften
[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]Als DNA-Polymerase des Typs B verlängert sie DNA-Sequenzen am 3′-Ende, wenn sie als DNA-Doppelstrang vorkommen und nach dem 3'-Ende mindestens ein Einzelstrang als Matrize vorliegt. Sie dient dem Phagen zur DNA-Replikation des viralen Genoms. Bei ringförmiger DNA wie Plasmiden erfolgt eine rolling circle replication.[1] Bei der Replikation bildet die φ29-DNA-Polymerase ein Heterodimer mit dem Primer Terminal Protein (TP) und bindet an den Replikationsursprung an einem der beiden 5'-Enden der Phagen-DNA. Die Hydroxygruppe des Serins an der Position 232 dient als Primer. φ29-DNA-Polymerase besitzt drei Enzymaktivitäten: DNA-Replikation, Desoxynukleotidylierung des TP mit Desoxy-Adenosinmonophosphat über einen Phosphorsäureester-Übergangszustand und eine 3′→5′-Exonuklease des Typs II zur Fehlerkorrektur (proof-reading). Während die Exonuklease für eine geringe Fehlerrate während der Synthese sorgt, ist die Bindung des TP und der Beginn der Synthese vergleichsweise fehlerhaft. Sie beginnt bei der zweiten Thyminbase und gleitet dann ein paar Basen zurück. Die φ29-DNA-Polymerase ist strangversetzend, wodurch eine Synthese auch an einem Doppelstrang erfolgen kann. Das Leucin an der Position 384 ist an der Spezifität der Bindung von Desoxynukleotiden beteiligt.[2] Tyrosine an den Positionen 226 und 390 sind an der Translokation entlang der Matrize beteiligt.[3] Die Φ29-DNA-Polymerase besitzt eine höhere Affinität zu einzelsträngiger als zu doppelsträngiger DNA. Die Tyrosine an den Positionen 256 und 390 bewirken eine Erhöhung der Affinität der Nukleotidbindung.[4] Das Tyrosin an der Position 59, das Histidin an der Position 61 und ein Phenylalanin an der Position 69 dienen der DNA-Bindung der Exonuklease.[5] Die φ29-DNA-Polymerase ist keine thermostabile DNA-Polymerase.
Die Φ29-DNA-Polymerase katalysiert die Reaktion:
Desoxynukleosidtriphosphat + DNA(n) Diphosphat + DNA(n+1)
Anwendungen
[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]Die φ29-DNA-Polymerase wird in der Biochemie zur isothermen DNA-Amplifikation eingesetzt, z. B. beim Gibson Assembly. Eine thermostabile Alternative ist das bei 65 °C thermostabile große Fragment der Bst-DNA-Polymerase aus Bacillus stearothermophilus.
Die Φ29-DNA-Polymerase wird zur Kopie von Genomen eingesetzt (Genomamplifikation, engl. whole genome amplification, WGA),[6] da sie eine hohe Prozessivität,[7] eine geringe Fehlerrate (wegen proof reading),[8] einen geringen bias besitzt[9] und weil sie lange DNA-Fragmente über 10kb und eine höhere Produktkonzentration als thermostabile DNA-Polymerasen erzeugt.[9] Als isothermale Methode wird zudem kein Thermocycler benötigt, als Primer werden bei der WGA oftmals zufällige Nukleotid-Hexamere verwendet.
Literatur
[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]- Luis Blanco, Margarita Salas: Mutational analysis of bacteriophage phi 29 DNA polymerase. In: Methods in Enzymology. Band 262, 1995, S. 283–294, doi:10.1016/0076-6879(95)62024-9, PMID 8594354, Epub 7. Januar 2004.
Weblinks
[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]Einzelnachweise
[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]- ↑ F. B. Dean, J. R. Nelson, T. L. Giesler, R. S. Lasken: Rapid amplification of plasmid and phage DNA using Phi 29 DNA polymerase and multiply-primed rolling circle amplification. In: Genome Research. Band 11, Nummer 6, Juni 2001, S. 1095–1099, doi:10.1101/gr.180501, PMID 11381035, PMC 311129 (freier Volltext).
- ↑ V. Truniger, J. M. Lázaro, M. de Vega, L. Blanco, M. Salas: phi 29 DNA polymerase residue Leu384, highly conserved in motif B of eukaryotic type DNA replicases, is involved in nucleotide insertion fidelity. In: The Journal of Biological Chemistry. Band 278, Nummer 35, August 2003, S. 33482–33491, doi:10.1074/jbc.M303052200, PMID 12805385.
- ↑ J. M. Dahl, H. Wang, J. M. Lázaro, M. Salas, K. R. Lieberman: Dynamics of translocation and substrate binding in individual complexes formed with active site mutants of {phi}29 DNA polymerase. In: The Journal of Biological Chemistry. Band 289, Nummer 10, März 2014, S. 6350–6361, doi:10.1074/jbc.M113.535666, PMID 24464581, PMC 3945302 (freier Volltext).
- ↑ J. Saturno, L. Blanco, M. Salas, J. A. Esteban: A novel kinetic analysis to calculate nucleotide affinity of proofreading DNA polymerases. Application to phi 29 DNA polymerase fidelity mutants. In: The Journal of Biological Chemistry. Band 270, Nummer 52, Dezember 1995, S. 31235–31243, PMID 8537389.
- ↑ M. de Vega, J. M. Lázaro, M. Salas: Phage phi 29 DNA polymerase residues involved in the proper stabilisation of the primer-terminus at the 3'-5' exonuclease active site. In: Journal of Molecular Biology. Band 304, Nummer 1, November 2000, S. 1–9, doi:10.1006/jmbi.2000.4178, PMID 11071805.
- ↑ Alsmadi O, Alkayal F, Monies D, Meyer BF: Specific and complete human genome amplification with improved yield achieved by phi29 DNA polymerase and a novel primer at elevated temperature. In: BMC Res Notes. 2. Jahrgang, 2009, S. 48, doi:10.1186/1756-0500-2-48, PMID 19309528, PMC 2663774 (freier Volltext).
- ↑ L. Blanco, A. Bernad, J. M. Lázaro, G. Martín, C. Garmendia, M. Salas: Highly efficient DNA synthesis by the phage phi 29 DNA polymerase. Symmetrical mode of DNA replication. In: The Journal of biological chemistry. Band 264, Nummer 15, Mai 1989, S. 8935–8940, PMID 2498321.
- ↑ T. J. Pugh, A. D. Delaney, N. Farnoud et al.: Impact of whole genome amplification on analysis of copy number variants. In: Nucleic Acids Res. 36. Jahrgang, Nr. 13, August 2008, S. e80, doi:10.1093/nar/gkn378, PMID 18559357, PMC 2490749 (freier Volltext).
- ↑ a b R. Pinard, A. de Winter, G. J. Sarkis et al.: Assessment of whole genome amplification-induced bias through high-throughput, massively parallel whole genome sequencing. In: BMC Genomics. 7. Jahrgang, 2006, S. 216, doi:10.1186/1471-2164-7-216, PMID 16928277, PMC 1560136 (freier Volltext).